自動化蛋白質組樣品制備：高通量和定量質譜分析的關鍵
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原名： Automated proteomic sample preparation: The key component for high throughput and quantitative mass spectrometry analysis
譯名：自動化蛋白質組樣品制備：高通量和定量質譜分析的關鍵
期刊：Mass Spectrometry Reviews
IF：10.946
發表時間：2021.10
2.1 蛋白質變性
蛋白質變性是消化樣品的關鍵步驟。蛋白質二級結構打開有利于烷基化和酶切。變性有利于提高蛋白水解效率，最終提高樣品制備的重復性。在蛋白質提取過程中，去垢劑被廣泛使用，尤其是十二烷基硫酸鈉(SDS)。然而，在隨后的LC - MS/MS分析中去垢劑可能存在嚴重的干擾問題。其他的試劑，如尿素或胍-鹽酸，也可以用來使蛋白質變性，但也會干擾質譜分析，需要在蛋白質水解后從樣品中移除。在酸性條件下不穩定的去垢劑（ALS）兼容質譜，如Rapigest SF。Rapigest SF是SDS類似物，是裂解蛋白質的表面活性劑，在酸性條件下可以被分解，分解后不干擾質譜鑒定。去垢劑的成本高，因此對于大規模的隊列質譜鑒定成本更高，但是一些ALSs高效實用。
Proc等人的研究發現50%(v/v)2-2-2三氟乙醇(TFE)可以用于血漿蛋白質提取，結果與SDS提取類似。許多研究表明TFE對蛋白質結構有影響，能溶解球狀蛋白的疏水核心使膜蛋白變性。此外，Reiersen等人證明TFE濃度≥30%(v/v)和溫度為58.6℃是最優的變性條件。TFE可以用于血液、血漿、尿液、組織和細胞的蛋白質提取。TFE的廣泛應用，儀器兼容性以及揮發性的特點使其在樣品制備中具有顯著的優勢。
2.2 還原和烷基化
變性后，蛋白質被進一步還原并烷基化，打破維持蛋白質三級結構的二硫鍵，并防止游離半胱氨酸再次形成二硫鍵。打開半胱氨酸的二硫鍵提高蛋白質的酶切效率和降低數據搜庫的難度。還原反應通常在較高的溫度下進行，還原劑主要包括二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇(2-ME)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羥丙基)膦(THPP)。烷基化使用碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺(AA)、甲基甲硫磺酸鹽(MMTS)、N-乙基馬來酰亞胺(N -EM)或4-乙烯基吡啶(4-VP)實現。這兩類試劑參與樣品制備過程中的還原烷基化過程，每個反應都需要評估其完整性或副反應，副反應會改變鑒定的肽段原有的質量。Suttapitugsakul等人對還原和烷基化條件的綜合評估。
2.3 酶解
自下而上的蛋白質組學需要將蛋白進行酶切然后進行數據庫搜索。胰蛋白酶由于酶切的特異性(在賴氨酸和精氨酸殘基之后)和較高的酶活，因此是蛋白質組學實驗中最常用的蛋白酶。用胰蛋白酶消化產生大小為500-5000Da的肽段且有好的蛋白覆蓋率。其他幾種蛋白酶都有各自的特異性，如胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Asp-N或蛋白酶K。蛋白酶可以單獨使用或與胰蛋白酶聯合使用增加酶切位點，提高序列覆蓋度。對于任何蛋白質水解，有效的消化取決于優化酶與蛋白質的比例、溫度和溫度。
左圖為三種不同消化條件的CV%如圖所示:手動消化(紅色)、未優化的自動消化(綠色)和優化的自動消化(藍色)。重現性用面積比(輕標/重標SIL)和CV值進行評估，CV值是通過β-gal酶切肽段加入到健康的人血漿來評估（4-8個重復）。血漿樣品變性、還原、烷基化并用胰蛋白酶消化。平均面積比CV% β-gal和輕標的峰面積(輕標/重標SIL)計算人血清白蛋白。MRM數據采用6500QTRAP采集。右圖顯示自動固相萃取(24孔)的CV%。β-gal和人血清白蛋白SIL多肽加入酶切后的健康人的血漿樣品中，用整合i7自動控制裝置工作站的正壓裝置脫鹽。脫鹽后SIL重標肽信號計算CV%。MRM數據同樣由LC‐MS獲得。CV %是從7次重復注射中計算出來。SIL，穩定同位素標記。
2.4.終止
消化后，在酸性條件下終止反應，酸化的肽段進行脫鹽。常用的幾種揮發性酸:甲酸、乙酸或三氟乙酸。在18O標記的情況下，酶切終止有利于防止胰蛋白酶介導的重標反向交換。
2.5 脫鹽
用高分辨率質譜儀(如Orbitrap、TripleTOF或TimsTOF)分析肽段需要進行脫鹽，實現去除污染物并濃縮肽段的目的。通常使用C18樹脂特異性地結合多肽去除污染物。固相萃取可以通過手動真空提取或正壓裝置來實現(手動或自動)。手動調解真空影響重現性，建議使用正壓裝置。在自動化的工作站上整合正壓除鹽裝置。采用集成的自動化正壓裝置，壓力由氮氣調節，流速和時間根據樣品和溶劑類型預先編程，從而實現回收產物的均一性和可重復性。
最近出現了一些創新步驟，將樣品制備步驟整合到一個獨立的柱或槍尖上。S-trap利用多孔材料捕獲變性的蛋白質溶液，去除污染物，對蛋白質進行還原、烷基化和消化。這種方法在樣品制備過程中有效的去除污染物和表面活性劑。Chen等人提出并擴展了類似的方法，集成的旋轉槍尖蛋白質組學技術(SISPROT)利用強陽離子交換珠和C18樹脂，實現樣品消化等步驟，包括最終脫鹽完全整合到單個槍尖上，從而實現快速，高靈敏度，樣品損失小的優點。該方法與一些翻譯后修飾的富集兼容。在自動化的流程中，樣品制備的一體化和簡化很重要。
開發自動化流程進一步考慮是試劑的選擇，試劑應該具備可分裝的特點從而減少試劑的批量化效應。在96孔板里，外源蛋白β-半乳糖可用于質量控制監測自動蛋白質組學樣品制備工作流程的再現性和準確性。在還原和烷基化反應之前加入β-半乳糖蛋白及其相應SIL肽標準的混合物。建立優化的自動化工作流程，評估幾天內的重現性很重要。對于標準化自動化工作流程，同時需要在多個實驗室進行重復。
3.定量質譜法
樣品準備完成后，使用高性能質譜技術分析樣品進行疾病生物標志物的發現或驗證研究。基于發現蛋白質組學，通常使用數據依賴型采集(DDA-MS)或非數據依賴型采集(DIA-MS)方法提供生物樣本定量評估。在DDA-MS中，所有前體離子在一級掃描期間被掃描(MS1)，然后選擇一些離子進行碎裂，產生一系列串聯質譜(MS/MS或MS2)。所有的譜圖在數據庫中進行搜索，匹配到肽段和蛋白質。DDA是針對前N個母離子(設定特定數量的前體離子且信號高于“噪聲”)進行采樣，碎裂產生二級譜圖，所以影響低豐度肽和蛋白質的定量和定性。
在DIA-MS中，定義的質荷比(m/z)窗口內所有前體離子都可能碎裂。碎片離子在特定的隔離窗口中積累。由于所有檢測到的前體離子都可以被碎裂，所以DIA-MS的優勢在于能夠準確定量，而不受DDA-MS前體離子碎裂數量的限制。DIA-MS方法需要產生高分辨率二級譜圖的質譜儀。
除了發現標志物，還需要在大量患者樣本中有針對性的驗證。目前，驗證的方法有多反應監測質譜(MRM-MS)，也被稱為選擇性反應監測質譜(SRM-MS)，平行反應監測質譜(PRM-MS)，以及Sure-Quant質譜法(SQ-MS)。Sure-Quant質譜法(SQ-MS)可對體液、穿刺樣本或培養細胞的肽段中特定的肽段進行精確定量。SRM-MS利用高重復性三重四極桿(QqQ)質譜儀選擇肽段進行定量分析。SRM-MS的優勢在于肽/蛋白定量的選擇性、敏感性和多重性。PRM-MS是一種類似SRM的靶向方法，需要高分辨率和高質量精度(HR/AM)的質譜儀進行二級譜圖采集。多肽和蛋白質定量具有高度的選擇性和特異性。SQ-MS是最近開發的一種利用HR/AM Orbitrap質譜儀靶向采集方法。用動態變化的質譜參數監測樣品中的參考內標。該方法提高了內源性肽定量的數據質量并且可以實現大量靶點肽段的定量。
4. 實現自動蛋白質組學樣品制備
蛋白質組學實驗的成功與否很大程度上取決于樣品制備的速度和質量。在樣品制備流程中通過自動化的工作站提高樣品通量和準確度。自動化工作站需要以下功能:(1)在精確的時間里控制液體轉移，(2)從試劑瓶/盤中轉移液體到酶解盤，(3)96/364針和/或8跨度的頭，(4)移動酶解盤，(5)溫度和時間控制的容器可以震動，(6)一個獨立的平板搖床，用作攪拌機。這些特點使人類的雙手從重復和勞動密集的步驟中解放出來，并提高大量樣品的準確性和重現性。在文獻中，越來越多的例子表明，在高通量臨床、病理、制藥和研究領域利用自動化工作站進行蛋白質組學樣品制備(表2)。下面的部分描述了幾個關鍵的研究，以及自動化工作流程的性能。
4.1 直接消化‐質譜
生物液體，如血漿、血清、CSF、尿液以及血液，包括Whatman收集紙收集的干的血液或體積吸收微采樣(VAMS)收集到的干的血液，這些生物液體是復雜的基質，有豐富的蛋白質組信息。在臨床前和臨床研究中，有幾項研究利用自動化工作站開發了蛋白質消化和定量質譜分析的自動化工作流程(表2)。直接消化是樣品制備最簡單的形式，不需要從細胞或組織中提取特定的物質或特定的富集/去除步驟。例如,Biomek NX?(貝克曼庫爾特有限公司)的自動化工作流程直從Mitra(一種體積吸收微采樣設備)消化干燥血液，Mitra結合高流速LC和靈敏的三重四級桿質譜儀，利用MRM方法實現高精度地定量高豐度蛋白(CV<20%)。在另一項研究中,Bravo(安捷倫)96通道液體處理器用于處理干血滴(DBS),結合高流速LC-MS定量肽段，如載脂蛋白A-I,B, C-II C-III和E,利用MRM的技術實現CV<6%。另一項研究使用Tecan Freedom液體處理自動化工作站對來自DBS樣品的97種血液蛋白進行定量，每條肽的樣品內重復和樣品間重復CV<12%(包括MS CV)。
4.2 固相萃取
這個工作流程已經在臨床實驗室實現，Quest Diagnostics報告了一種高通量MS分析確定CSF中β-淀粉樣蛋白中1-42(A42)與β-淀粉樣蛋白1-40 (A40)的比例，診斷和區分阿爾茨海默病患者和健康對照者。CSF胰蛋白酶消化后采用基于漢密爾頓自動化液體處理程序的固相萃取自動化工作流程完成。我們團隊已經使用i7混合液體處理工作站的正壓裝置脫鹽。液體處理%CV為6%左右(包括脫鹽步驟時，總%CV為~10%;未脫鹽總%CV約為4%)(圖3右下圖)。
4.3 質量控制
單克隆抗體(mABs)治療已迅速成為各種疾病治療的重要治療手段，包括癌癥、慢性炎癥和病理性感染。最近，美國食品和藥物管理局(FDA)已批準使用單克隆抗體治療COVID-19。對于生物制藥行業來說，監測mAB的質量控制至關重要，包括重組序列驗證。實驗室使用自動樣品制備方法對單抗質量控制進行研究，該方法使用KingFisher液體處理工作站(賽默飛)通過質譜方法匹配mAB多肽。該團隊還使用相同的自動化流程進行了實驗室間研究，以證明mAB產品質量控制的一致性。
4.4 免疫親和富集和去除
血液蛋白質組(和由此產生的血漿和血清亞蛋白質組)的蛋白質濃度范圍跨度大;~1010個蛋白質，濃度跨度從mg/ml到pg/ml。高豐度的蛋白抑制了低豐度蛋白的檢測。為了提高低峰度蛋白的靈敏度，免疫親和(IA)方法成功地應用于自動樣品制備。例如，Lassman等人使用特異性抗體富集低豐度的血漿膽甾醇酯轉移蛋白(CEPT)和Kexin樣前轉化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第9個成員(PSCK9)，使用優化的自動化IA程序(Freedom EVO, Tecan Trading)在不到3周的時間內對1400份血漿樣本分析，實現樣品內和樣品間的CV低于15%。
在免疫捕獲工作流程中，使用穩定同位素標準和抗肽抗體捕獲(SISCAPA或免疫MRM [iMRM])。進行蛋白水解，捕獲帶有特異性抗體的肽段，通過質譜進行檢測和定量，iMRM測定臨床蛋白(>10分析物)，如胱抑素C, C反應蛋白，載脂蛋白E，載脂蛋白CIII和其他蛋白質。血漿、血清和DBSs都可以用iMRM分析。多個自動化工作站和平臺成功使用iMRM方法分析血漿生物標志物，如Bravo自動液體處理器(安捷倫)，KingFisher磁粒子處理器(賽默飛)，和漢密爾頓液體處理工作站(漢密爾頓)。這些液體處理工作站表明自動化可以實現快速胰蛋白酶消化和免疫捕獲且單日內和單日間的CV值均小于10%。
此外，iMRM抗肽抗體捕獲的一個優點是酶切后暴露了不易接觸的表位。因此，iMRM可以在降低干擾的同時對臨床上血漿生物標志物進行定量。例如,甲狀腺球蛋白,循環腫瘤標記物作為標志物評估甲狀腺癌治療有效性,抗甲狀腺球蛋白自動化抗體的缺失阻礙抗原決定簇鑒定假陰性結果。因此，開發了一種自動iMRM分析樣品制備流程來測量特定的甲狀腺球蛋白酶切后肽段。血漿蛋白經胰蛋白酶消化后，采用自動液體處理工作站(來自Eppendorf的epMotion)利用特異性抗體選擇性富集甲狀腺球蛋白特異性肽。富集后，用質譜檢測內源性甲狀腺球蛋白肽和標肽，該方法能夠滿足臨床診斷所需的標準(CV < 20%)。
4.5 從細胞或組織中提取蛋白質
與體液樣品處理相比，細胞、腫瘤或組織的蛋白水解消化的自動化工作站需要額外的處理步驟。主要步驟包括組織或腫瘤破碎、細胞裂解、DNA剪切和蛋白質提取、蛋白質變性和消化步驟。最近，Müller等人開發了一種方法，整合了自適應聚焦聲學技術(AFA)和單點固相增強樣品制備(SP3，磁珠參考http://www.kismrs.cn/Product/1736805216.html)在液體處理工作站上，用96孔板自動處理組織裂解物。AFA超聲是一種先進的聲學技術，可以通過96孔板聚焦超聲對樣品進行機械加工。SP3利用磁珠在有機溶劑(>50% ACN或EtOH)下促進蛋白質結合到珠子上的原理，再清洗磁珠去除污染物和去垢劑。工作流程實現全程自動化細胞或組織樣品制備。最近報道的SP2工作流程(一種羧酸修飾順磁粒子的替代適應性，利用液體處理程序(epMotion工作站，Eppendorf)進行肽分離)可以有效去除污染物(洗滌劑和鹽)以及在質譜鑒定前除鹽步驟(Waas等人，2019)。
4.6 COVID-19
COVID-19大流行體現將自動樣本制備應用到臨床實驗室的必要性和緊迫性。大流行加速了臨床實驗室對快速、準確的自動RNA檢測的需求。最近，發表了一些使用質譜技術在臨床實驗室進行COVID-19相關篩查的報告。Cardozo等人開發了一種自動化制備樣品的方法并結合高通量靶向LC-MS/MS方法，檢測鼻和咽拭子中的SARS-Cov-2核蛋白肽。96個樣品的自動酶解可以在4小時內完成，LC/MS每10分鐘運行4個樣品，每天可分析500個樣品。另一項研究利用PRM-MS對COVID-19刺突糖蛋白和核蛋白進行檢測，通過基于免疫親和的富集和溶液酶解的自動化樣品制備。采用PRM-MS的采集模式進行采集，檢測COVID - 19刺突糖蛋白和核蛋白。
5.臨床蛋白質組學中的自動化-未來展望
除了蛋白質酶切自動化，樣品制備的其他步驟自動化也有優點。例如，自動收集樣品(條形碼和驗證)進行分塊、存儲和存檔，簡化大型臨床隊列的管理。運送和裝載樣品到樣品制備工作站的自動化消除許多耗時和容易出錯的步驟。全自動化的發展將包括高質量、預先包裝的、即用型的試劑的標準化。自動化技術、液體處理、質譜分析、數據處理和出報告整個流程縮短時間和成本，同時提高后續分析的可靠性和精度。磁珠法在蛋白質組學樣品前處理上具有廣泛用途（如SP3磁珠、蛋白冠磁珠等。）
質譜技術的快速發展與各種自動化樣品制備工作流程相結合，將在常規臨床實驗室中變得普遍。高分辨率、高精確的質譜儀器有利于多個樣本的分析。目前，自動樣品制備方法可用于發現蛋白質組學(DDA-MS，DIA-MS)和靶向蛋白質組學(PRM-MS;MRM/SRM-MS, SQ-MS)。然而，自動化工具和工作流程需要靈活應對新的質譜方法。結合自動化樣品制備和高通量、高特異性和高靈敏度的LC-MS/MS檢測方法是蛋白質組學技術從基礎研究領域走向臨床實驗室和精準醫學的關鍵。
評估生物材料的一個基本要求是將其細化到分析。在蛋白質組學中，自動化樣本采集對于提高生物標志物發現、驗證、臨床前、臨床和藥物研究中蛋白質的一致性和定量準確性至關重要。在常規臨床實驗室中，需要開發和優化精確度高、重現性高和穩定好的樣品制備流程。在實現高通量基礎上不斷改進蛋白質組學樣品制備的自動化技術是將質譜和蛋白質組學整合到個性化藥物的關鍵。
原文鏈接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34786750/
譯名：自動化蛋白質組樣品制備：高通量和定量質譜分析的關鍵
期刊：Mass Spectrometry Reviews
IF：10.946
發表時間：2021.10
通訊作者：Jennifer E. VanEyk
1.引言
液相色譜質譜(LC -MS)儀器的改進和生物信息學的發展，促進了基于質譜的蛋白質和肽段定量方法的發展。質譜作為基礎的臨床研究工具，單針可定量1000個蛋白質。血液或尿液等生物液體是一種很容易獲得的樣本，通過這些樣本可深入了解患者的健康或疾病狀況。質譜可用于識別組織或生物液體中的生物標志物，進行診斷、分期、監測或預測疾病的病理或臨床結果。
開發用于臨床的生物標志物需要兩個階段：發現和驗證。發現階段的特點是對患者樣本進行全面分析，以開發候選生物標志物。這通常使用數據依賴型采集方法(DDA)或非數據依賴型采集（DIA）(下文討論)來完成。在這個階段，需要可信的定量信息。當一個或多個候選標志物已經確定，標志物需要使用更大的患者隊列進行驗證，以建立在臨床應用中特異性和敏感性的標志物。這種方法利用了多種/選擇性反應監測(M/SRM)、平行反應監測(PRM)或確定定量質譜(SQ - MS)等有靶向定量質譜方法(下文討論)。這些方法為復雜的生物樣品提供了全面和準確的肽段定量信息。
無論基于發現蛋白質組學或靶向蛋白質組學，質譜分析前基本步驟是樣品制備。在質譜分析之前，蛋白質樣品經過一系列步驟被消化成多肽。然而，重復性、時間和成本仍然是大規模和高通量質譜樣品處理的障礙。為了解決這個問題，開發快速和準確的蛋白樣品制備工作流程是必要的，從而提高檢測通量，促進從生物標志物的發現到臨床應用。改進樣品制備的一項新型創新方法是利用自動化操作工作站，可以準確可靠地完成樣品制備中復雜的流程。在接下來的章節中，我們概述了在質譜樣品制備方案中自動化步驟的優化，并描述自動化在發現、驗證和臨床蛋白質組學工作流程中是如何實現的。
2.LC-MS樣品制備的基本步驟和優化
蛋白質組樣品制備過程中，有幾個關鍵的步驟，根據實驗可能需要進一步優化這些步驟。步驟包括(1)蛋白質濃度測量;(2)蛋白質變性;(3)還原;(4)烷基化;(5)消化，如胰蛋白酶進行消化;(6)終止消化;(7)通過固相萃取方法脫鹽，目的是以去除干擾成分(圖1)。樣品制備過程中的每個步驟的優化對于獲得一個可靠的、可重復的定量蛋白質組學流程至關重要。臨床生物標志物驗證的精確度需要滿足單日內和單日間的CV值小于20%。表1列出了實現預期性能和可重復性時所需的參數建議。變性劑、胰蛋白酶(或其他酶)與底物比率、緩沖液組成、孵育時間、溫度等特性都應進行評估，以了解這些參數對質譜的靈敏度和蛋白質組的可靠性的影響。然后對這些參數進行手動化和自動化評估。使用自動化工作站，可以更好的實現對液體處理、混合、孵育時間和溫度的控制。
圖1.蛋白質組學樣品制備過程示意圖
上部分圖總結了樣品類型和不同的自動化流程，質譜采集方法。下部分圖是蛋白質組學樣品制備的基本步驟
表1.樣品自動制備技術的優化
2.1 蛋白質變性
蛋白質變性是消化樣品的關鍵步驟。蛋白質二級結構打開有利于烷基化和酶切。變性有利于提高蛋白水解效率，最終提高樣品制備的重復性。在蛋白質提取過程中，去垢劑被廣泛使用，尤其是十二烷基硫酸鈉(SDS)。然而，在隨后的LC - MS/MS分析中去垢劑可能存在嚴重的干擾問題。其他的試劑，如尿素或胍-鹽酸，也可以用來使蛋白質變性，但也會干擾質譜分析，需要在蛋白質水解后從樣品中移除。在酸性條件下不穩定的去垢劑（ALS）兼容質譜，如Rapigest SF。Rapigest SF是SDS類似物，是裂解蛋白質的表面活性劑，在酸性條件下可以被分解，分解后不干擾質譜鑒定。去垢劑的成本高，因此對于大規模的隊列質譜鑒定成本更高，但是一些ALSs高效實用。
Proc等人的研究發現50%(v/v)2-2-2三氟乙醇(TFE)可以用于血漿蛋白質提取，結果與SDS提取類似。許多研究表明TFE對蛋白質結構有影響，能溶解球狀蛋白的疏水核心使膜蛋白變性。此外，Reiersen等人證明TFE濃度≥30%(v/v)和溫度為58.6℃是最優的變性條件。TFE可以用于血液、血漿、尿液、組織和細胞的蛋白質提取。TFE的廣泛應用，儀器兼容性以及揮發性的特點使其在樣品制備中具有顯著的優勢。
2.2 還原和烷基化
變性后，蛋白質被進一步還原并烷基化，打破維持蛋白質三級結構的二硫鍵，并防止游離半胱氨酸再次形成二硫鍵。打開半胱氨酸的二硫鍵提高蛋白質的酶切效率和降低數據搜庫的難度。還原反應通常在較高的溫度下進行，還原劑主要包括二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇(2-ME)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羥丙基)膦(THPP)。烷基化使用碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺(AA)、甲基甲硫磺酸鹽(MMTS)、N-乙基馬來酰亞胺(N -EM)或4-乙烯基吡啶(4-VP)實現。這兩類試劑參與樣品制備過程中的還原烷基化過程，每個反應都需要評估其完整性或副反應，副反應會改變鑒定的肽段原有的質量。Suttapitugsakul等人對還原和烷基化條件的綜合評估。
2.3 酶解
自下而上的蛋白質組學需要將蛋白進行酶切然后進行數據庫搜索。胰蛋白酶由于酶切的特異性(在賴氨酸和精氨酸殘基之后)和較高的酶活，因此是蛋白質組學實驗中最常用的蛋白酶。用胰蛋白酶消化產生大小為500-5000Da的肽段且有好的蛋白覆蓋率。其他幾種蛋白酶都有各自的特異性，如胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Asp-N或蛋白酶K。蛋白酶可以單獨使用或與胰蛋白酶聯合使用增加酶切位點，提高序列覆蓋度。對于任何蛋白質水解，有效的消化取決于優化酶與蛋白質的比例、溫度和溫度。
圖2.生物學、功能、結構和序列復雜性闡述人類蛋白質組
Swiss‐Prot數據庫報道的蛋白質和異構體數;八大類生物功能相關的總蛋白質(https://www.nextprot.org/about/statistics)
之前的研究表明，蛋白質酶切步驟是LC-MS分析中不穩定性的主要來源。不穩定性的主要驅動因素之一是大多數蛋白質組固有的復雜性。人類蛋白質組來源于2萬多個基因，同一個基因產生多個異構體以及多翻譯后修飾(PTMs)等。蛋白質異構體在時間和空間上調控個體的生理或病理狀態(圖2)。蛋白質濃度有大的動態范圍，在一個樣品中，高豐度的蛋白比低豐度蛋白高出10個數量級。為了獲得最優的人體血漿酶切效率，研究14種不同的蛋白質變性條件。不同基質(血漿、血清、腦脊液[CSF]和其他蛋白質組樣品)的蛋白裂解是復雜的，每個蛋白都有各自的三級、四級結構和酶切位點。檢測外源添加細菌蛋白β-半乳糖苷酶(β‐gal)發現171份人類血漿樣本處理的變異系數(CV)在18%-25%。使用兩種蛋白質(外源性β-gal和內源性人血清白蛋白)作為自動消化監測的代表性分析物，白蛋白和β-gal的峰值面積比(天然/穩定同位素標記[SIL]肽信號)在優化前分別為30%CV和20%CV。優化自動化工作站后，內源性人血清白蛋白和外源添加的β-gal蛋白的CV分別達到3%和4%-8%(圖3)。
圖3.評價自動化蛋白質組學樣品制備
左圖為三種不同消化條件的CV%如圖所示:手動消化(紅色)、未優化的自動消化(綠色)和優化的自動消化(藍色)。重現性用面積比(輕標/重標SIL)和CV值進行評估，CV值是通過β-gal酶切肽段加入到健康的人血漿來評估（4-8個重復）。血漿樣品變性、還原、烷基化并用胰蛋白酶消化。平均面積比CV% β-gal和輕標的峰面積(輕標/重標SIL)計算人血清白蛋白。MRM數據采用6500QTRAP采集。右圖顯示自動固相萃取(24孔)的CV%。β-gal和人血清白蛋白SIL多肽加入酶切后的健康人的血漿樣品中，用整合i7自動控制裝置工作站的正壓裝置脫鹽。脫鹽后SIL重標肽信號計算CV%。MRM數據同樣由LC‐MS獲得。CV %是從7次重復注射中計算出來。SIL，穩定同位素標記。
2.4.終止
消化后，在酸性條件下終止反應，酸化的肽段進行脫鹽。常用的幾種揮發性酸:甲酸、乙酸或三氟乙酸。在18O標記的情況下，酶切終止有利于防止胰蛋白酶介導的重標反向交換。
2.5 脫鹽
用高分辨率質譜儀(如Orbitrap、TripleTOF或TimsTOF)分析肽段需要進行脫鹽，實現去除污染物并濃縮肽段的目的。通常使用C18樹脂特異性地結合多肽去除污染物。固相萃取可以通過手動真空提取或正壓裝置來實現(手動或自動)。手動調解真空影響重現性，建議使用正壓裝置。在自動化的工作站上整合正壓除鹽裝置。采用集成的自動化正壓裝置，壓力由氮氣調節，流速和時間根據樣品和溶劑類型預先編程，從而實現回收產物的均一性和可重復性。
最近出現了一些創新步驟，將樣品制備步驟整合到一個獨立的柱或槍尖上。S-trap利用多孔材料捕獲變性的蛋白質溶液，去除污染物，對蛋白質進行還原、烷基化和消化。這種方法在樣品制備過程中有效的去除污染物和表面活性劑。Chen等人提出并擴展了類似的方法，集成的旋轉槍尖蛋白質組學技術(SISPROT)利用強陽離子交換珠和C18樹脂，實現樣品消化等步驟，包括最終脫鹽完全整合到單個槍尖上，從而實現快速，高靈敏度，樣品損失小的優點。該方法與一些翻譯后修飾的富集兼容。在自動化的流程中，樣品制備的一體化和簡化很重要。
開發自動化流程進一步考慮是試劑的選擇，試劑應該具備可分裝的特點從而減少試劑的批量化效應。在96孔板里，外源蛋白β-半乳糖可用于質量控制監測自動蛋白質組學樣品制備工作流程的再現性和準確性。在還原和烷基化反應之前加入β-半乳糖蛋白及其相應SIL肽標準的混合物。建立優化的自動化工作流程，評估幾天內的重現性很重要。對于標準化自動化工作流程，同時需要在多個實驗室進行重復。
3.定量質譜法
樣品準備完成后，使用高性能質譜技術分析樣品進行疾病生物標志物的發現或驗證研究。基于發現蛋白質組學，通常使用數據依賴型采集(DDA-MS)或非數據依賴型采集(DIA-MS)方法提供生物樣本定量評估。在DDA-MS中，所有前體離子在一級掃描期間被掃描(MS1)，然后選擇一些離子進行碎裂，產生一系列串聯質譜(MS/MS或MS2)。所有的譜圖在數據庫中進行搜索，匹配到肽段和蛋白質。DDA是針對前N個母離子(設定特定數量的前體離子且信號高于“噪聲”)進行采樣，碎裂產生二級譜圖，所以影響低豐度肽和蛋白質的定量和定性。
在DIA-MS中，定義的質荷比(m/z)窗口內所有前體離子都可能碎裂。碎片離子在特定的隔離窗口中積累。由于所有檢測到的前體離子都可以被碎裂，所以DIA-MS的優勢在于能夠準確定量，而不受DDA-MS前體離子碎裂數量的限制。DIA-MS方法需要產生高分辨率二級譜圖的質譜儀。
除了發現標志物，還需要在大量患者樣本中有針對性的驗證。目前，驗證的方法有多反應監測質譜(MRM-MS)，也被稱為選擇性反應監測質譜(SRM-MS)，平行反應監測質譜(PRM-MS)，以及Sure-Quant質譜法(SQ-MS)。Sure-Quant質譜法(SQ-MS)可對體液、穿刺樣本或培養細胞的肽段中特定的肽段進行精確定量。SRM-MS利用高重復性三重四極桿(QqQ)質譜儀選擇肽段進行定量分析。SRM-MS的優勢在于肽/蛋白定量的選擇性、敏感性和多重性。PRM-MS是一種類似SRM的靶向方法，需要高分辨率和高質量精度(HR/AM)的質譜儀進行二級譜圖采集。多肽和蛋白質定量具有高度的選擇性和特異性。SQ-MS是最近開發的一種利用HR/AM Orbitrap質譜儀靶向采集方法。用動態變化的質譜參數監測樣品中的參考內標。該方法提高了內源性肽定量的數據質量并且可以實現大量靶點肽段的定量。
4. 實現自動蛋白質組學樣品制備
蛋白質組學實驗的成功與否很大程度上取決于樣品制備的速度和質量。在樣品制備流程中通過自動化的工作站提高樣品通量和準確度。自動化工作站需要以下功能:(1)在精確的時間里控制液體轉移，(2)從試劑瓶/盤中轉移液體到酶解盤，(3)96/364針和/或8跨度的頭，(4)移動酶解盤，(5)溫度和時間控制的容器可以震動，(6)一個獨立的平板搖床，用作攪拌機。這些特點使人類的雙手從重復和勞動密集的步驟中解放出來，并提高大量樣品的準確性和重現性。在文獻中，越來越多的例子表明，在高通量臨床、病理、制藥和研究領域利用自動化工作站進行蛋白質組學樣品制備(表2)。下面的部分描述了幾個關鍵的研究，以及自動化工作流程的性能。
4.1 直接消化‐質譜
生物液體，如血漿、血清、CSF、尿液以及血液，包括Whatman收集紙收集的干的血液或體積吸收微采樣(VAMS)收集到的干的血液，這些生物液體是復雜的基質，有豐富的蛋白質組信息。在臨床前和臨床研究中，有幾項研究利用自動化工作站開發了蛋白質消化和定量質譜分析的自動化工作流程(表2)。直接消化是樣品制備最簡單的形式，不需要從細胞或組織中提取特定的物質或特定的富集/去除步驟。例如,Biomek NX?(貝克曼庫爾特有限公司)的自動化工作流程直從Mitra(一種體積吸收微采樣設備)消化干燥血液，Mitra結合高流速LC和靈敏的三重四級桿質譜儀，利用MRM方法實現高精度地定量高豐度蛋白(CV<20%)。在另一項研究中,Bravo(安捷倫)96通道液體處理器用于處理干血滴(DBS),結合高流速LC-MS定量肽段，如載脂蛋白A-I,B, C-II C-III和E,利用MRM的技術實現CV<6%。另一項研究使用Tecan Freedom液體處理自動化工作站對來自DBS樣品的97種血液蛋白進行定量，每條肽的樣品內重復和樣品間重復CV<12%(包括MS CV)。
4.2 固相萃取
這個工作流程已經在臨床實驗室實現，Quest Diagnostics報告了一種高通量MS分析確定CSF中β-淀粉樣蛋白中1-42(A42)與β-淀粉樣蛋白1-40 (A40)的比例，診斷和區分阿爾茨海默病患者和健康對照者。CSF胰蛋白酶消化后采用基于漢密爾頓自動化液體處理程序的固相萃取自動化工作流程完成。我們團隊已經使用i7混合液體處理工作站的正壓裝置脫鹽。液體處理%CV為6%左右(包括脫鹽步驟時，總%CV為~10%;未脫鹽總%CV約為4%)(圖3右下圖)。
表2 臨床前和臨床研究的自動化可定量得工作流程舉例
4.3 質量控制
單克隆抗體(mABs)治療已迅速成為各種疾病治療的重要治療手段，包括癌癥、慢性炎癥和病理性感染。最近，美國食品和藥物管理局(FDA)已批準使用單克隆抗體治療COVID-19。對于生物制藥行業來說，監測mAB的質量控制至關重要，包括重組序列驗證。實驗室使用自動樣品制備方法對單抗質量控制進行研究，該方法使用KingFisher液體處理工作站(賽默飛)通過質譜方法匹配mAB多肽。該團隊還使用相同的自動化流程進行了實驗室間研究，以證明mAB產品質量控制的一致性。
4.4 免疫親和富集和去除
血液蛋白質組(和由此產生的血漿和血清亞蛋白質組)的蛋白質濃度范圍跨度大;~1010個蛋白質，濃度跨度從mg/ml到pg/ml。高豐度的蛋白抑制了低豐度蛋白的檢測。為了提高低峰度蛋白的靈敏度，免疫親和(IA)方法成功地應用于自動樣品制備。例如，Lassman等人使用特異性抗體富集低豐度的血漿膽甾醇酯轉移蛋白(CEPT)和Kexin樣前轉化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第9個成員(PSCK9)，使用優化的自動化IA程序(Freedom EVO, Tecan Trading)在不到3周的時間內對1400份血漿樣本分析，實現樣品內和樣品間的CV低于15%。
在免疫捕獲工作流程中，使用穩定同位素標準和抗肽抗體捕獲(SISCAPA或免疫MRM [iMRM])。進行蛋白水解，捕獲帶有特異性抗體的肽段，通過質譜進行檢測和定量，iMRM測定臨床蛋白(>10分析物)，如胱抑素C, C反應蛋白，載脂蛋白E，載脂蛋白CIII和其他蛋白質。血漿、血清和DBSs都可以用iMRM分析。多個自動化工作站和平臺成功使用iMRM方法分析血漿生物標志物，如Bravo自動液體處理器(安捷倫)，KingFisher磁粒子處理器(賽默飛)，和漢密爾頓液體處理工作站(漢密爾頓)。這些液體處理工作站表明自動化可以實現快速胰蛋白酶消化和免疫捕獲且單日內和單日間的CV值均小于10%。
此外，iMRM抗肽抗體捕獲的一個優點是酶切后暴露了不易接觸的表位。因此，iMRM可以在降低干擾的同時對臨床上血漿生物標志物進行定量。例如,甲狀腺球蛋白,循環腫瘤標記物作為標志物評估甲狀腺癌治療有效性,抗甲狀腺球蛋白自動化抗體的缺失阻礙抗原決定簇鑒定假陰性結果。因此，開發了一種自動iMRM分析樣品制備流程來測量特定的甲狀腺球蛋白酶切后肽段。血漿蛋白經胰蛋白酶消化后，采用自動液體處理工作站(來自Eppendorf的epMotion)利用特異性抗體選擇性富集甲狀腺球蛋白特異性肽。富集后，用質譜檢測內源性甲狀腺球蛋白肽和標肽，該方法能夠滿足臨床診斷所需的標準(CV < 20%)。
4.5 從細胞或組織中提取蛋白質
與體液樣品處理相比，細胞、腫瘤或組織的蛋白水解消化的自動化工作站需要額外的處理步驟。主要步驟包括組織或腫瘤破碎、細胞裂解、DNA剪切和蛋白質提取、蛋白質變性和消化步驟。最近，Müller等人開發了一種方法，整合了自適應聚焦聲學技術(AFA)和單點固相增強樣品制備(SP3，磁珠參考http://www.kismrs.cn/Product/1736805216.html)在液體處理工作站上，用96孔板自動處理組織裂解物。AFA超聲是一種先進的聲學技術，可以通過96孔板聚焦超聲對樣品進行機械加工。SP3利用磁珠在有機溶劑(>50% ACN或EtOH)下促進蛋白質結合到珠子上的原理，再清洗磁珠去除污染物和去垢劑。工作流程實現全程自動化細胞或組織樣品制備。最近報道的SP2工作流程(一種羧酸修飾順磁粒子的替代適應性，利用液體處理程序(epMotion工作站，Eppendorf)進行肽分離)可以有效去除污染物(洗滌劑和鹽)以及在質譜鑒定前除鹽步驟(Waas等人，2019)。
4.6 COVID-19
COVID-19大流行體現將自動樣本制備應用到臨床實驗室的必要性和緊迫性。大流行加速了臨床實驗室對快速、準確的自動RNA檢測的需求。最近，發表了一些使用質譜技術在臨床實驗室進行COVID-19相關篩查的報告。Cardozo等人開發了一種自動化制備樣品的方法并結合高通量靶向LC-MS/MS方法，檢測鼻和咽拭子中的SARS-Cov-2核蛋白肽。96個樣品的自動酶解可以在4小時內完成，LC/MS每10分鐘運行4個樣品，每天可分析500個樣品。另一項研究利用PRM-MS對COVID-19刺突糖蛋白和核蛋白進行檢測，通過基于免疫親和的富集和溶液酶解的自動化樣品制備。采用PRM-MS的采集模式進行采集，檢測COVID - 19刺突糖蛋白和核蛋白。
5.臨床蛋白質組學中的自動化-未來展望
除了蛋白質酶切自動化，樣品制備的其他步驟自動化也有優點。例如，自動收集樣品(條形碼和驗證)進行分塊、存儲和存檔，簡化大型臨床隊列的管理。運送和裝載樣品到樣品制備工作站的自動化消除許多耗時和容易出錯的步驟。全自動化的發展將包括高質量、預先包裝的、即用型的試劑的標準化。自動化技術、液體處理、質譜分析、數據處理和出報告整個流程縮短時間和成本，同時提高后續分析的可靠性和精度。磁珠法在蛋白質組學樣品前處理上具有廣泛用途（如SP3磁珠、蛋白冠磁珠等。）
質譜技術的快速發展與各種自動化樣品制備工作流程相結合，將在常規臨床實驗室中變得普遍。高分辨率、高精確的質譜儀器有利于多個樣本的分析。目前，自動樣品制備方法可用于發現蛋白質組學(DDA-MS，DIA-MS)和靶向蛋白質組學(PRM-MS;MRM/SRM-MS, SQ-MS)。然而，自動化工具和工作流程需要靈活應對新的質譜方法。結合自動化樣品制備和高通量、高特異性和高靈敏度的LC-MS/MS檢測方法是蛋白質組學技術從基礎研究領域走向臨床實驗室和精準醫學的關鍵。
評估生物材料的一個基本要求是將其細化到分析。在蛋白質組學中，自動化樣本采集對于提高生物標志物發現、驗證、臨床前、臨床和藥物研究中蛋白質的一致性和定量準確性至關重要。在常規臨床實驗室中，需要開發和優化精確度高、重現性高和穩定好的樣品制備流程。在實現高通量基礎上不斷改進蛋白質組學樣品制備的自動化技術是將質譜和蛋白質組學整合到個性化藥物的關鍵。
原文鏈接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34786750/
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